復帰突然変異試験(Ames試験)とは
細菌を用いる復帰突然変異試験は、医療機器からの溶出物や化学物質が、遺伝子突然変異を誘発する性質 (変異原性)があるかどうかを調べる試験です。国内外を問わずほとんどのガイダンスにおいて実施が義務付けられている安全性試験のひとつであり、サルモネラ菌および大腸菌を用いて実施します。
細菌を用いる復帰突然変異試験は、アミノ酸代謝に関わる遺伝子に突然変異を起こした細菌 (アミノ酸要求性株) を用いる簡便なin vitro試験です。アミノ酸要求性株は、生育に必須のアミノ酸を細菌内で合成することができないため、それらアミノ酸が不足した寒天培地上では増殖できません。しかし、復帰変異(アミノ酸代謝に関わる遺伝子が正常に戻る)が生じると、その寒天培地上でも増殖し、コロニーを形成することができます。復帰突然変異試験では、形成された復帰変異コロニー数を陰性対照と比較して被験物質の変異原性を評価します。
試験方法
安全性試験に用いる検定菌株の組み合わせは適用するガイダンスに従いますが、一般的にはヒスチジン要求性株のサルモネラ菌から4菌株およびトリプトファン要求性株の大腸菌から1菌株の計5菌株を用います。
各検定菌について、被験物質を直接作用させる条件 (S9 mix非存在下) と酵素誘導したラット肝臓から調製した代謝酵素 (S9) を添加して作用させる条件(S9 mix存在下) の2条件を設定します。
平板培地上の復帰変異コロニー
| 検定菌株 | 特性 | |||
|---|---|---|---|---|
| 膜変異 (薬剤透過性) |
薬剤耐性因子* | 欠損修復遺伝子 | 突然変異の型 (標的塩基対) |
|
| TA100 | 有(高い) | 有(+pKM101) | uvrB | 塩基置換型(GC) |
| TA98 | 有(高い) | 有(+pKM101) | uvrB | フレームシフト型(GC) |
| TA1535 | 有(高い) | 無 | uvrB | 塩基置換型(GC) |
| TA1537 | 有(高い) | 無 | uvrB | フレームシフト換型(GC) |
| WP2 uvrA | 無(野生型) | 無 | uvrA | 塩基対置換型(AT) |
| WP2 uvrA/pKM101 | 無(野生型) | 有(+pKM101) | uvrA | 塩基対置換型(AT) |
判定方法および基準
いずれかの試験条件あるいは検定菌において、被験物質処理群における復帰変異コロニー数 (平均値) が陰性対照 (平均値) の2倍以上に増加し、その増加に用量依存性あるいは再現性が認められた場合に陽性 (変異原性を有する) と判定します。