細胞毒性試験

コロニー形成法は、少ない播種細胞数で6～11日間 (細胞株により異なる) 曝露を行い、１個の細胞が増殖して形成される細胞集落 (コロニー) を数えることによって、医療機器からの溶出物または原料化学物質の細胞毒性作用を評価する試験法です。

コロニー形成法 (抽出法) は、ISO 10993-5においても定量的方法としてAnnex Bに収載されています。

抽出に血清を含む培地を用いる抽出法では、細胞を播種した翌日に培養液を培地抽出液と交換して培養を続け、約1週間後に形成されたコロニーを数えます。

ブランク (陰性対照) 群のコロニー数 (平均値) に対する各培地抽出液処理群のコロニー数 (平均値) の割合 (相対コロニー形成率、％) を求めます。

試験試料の培地抽出液中に細胞毒性作用を示す溶出物が存在する場合、抽出液濃度 (％) に依存してコロニー数が減少するため、相対コロニー形成率も同様に減少します。

相対コロニー形成率が70%未満に低下した場合、細胞毒性作用があると評価します。

また、相対コロニー形成率が50％となる抽出液濃度を求めることによって医療機器の細胞毒性作用の強度を評価します。

さらに、同時に実施した陽性対照材料のIC50と比較することにより、毒性作用の程度を知ることができます。

眼科領域で用いる医療機器や長期埋植される医療機器で推奨されている直接接触法では、培養容器の底面に置いた試験試料の上に細胞を播種したのち、培養します。培養後、抽出法と同様に形成されたコロニーを数えます。

直接接触法では、医療機器の表面における物理学的・化学的な性状が原因で細胞接着が正常に行われず、その結果としてコロニー形成に影響を及ぼす場合があります。

そのため医療機器表面における細胞付着性が未知の医療機器については、間接接触法として、セルカルチャーインサート法の実施が推奨されます。

国内の医療機器ガイダンスでは、直接接触法におけるコロニー形成率が30％未満かつ、抽出法におけるコロニー形成率が70%未満の場合、細胞毒性作用ありと評価します。

海外のガイダンスであるISO 10993-5およびUSP 43-NF 38 (2020) “Biological Tests/<87> Biological Reactivity Tests, In Vitro” (USP) には複数の試験法が記載されています。

コロニー形成法 (ISO 10993-5, Annex B) を除く全ての試験法は、細胞密度の高い条件下で細胞を曝露したのち、医療機器の細胞毒性作用を評価します。ISO 10993-5では、細胞毒性の決定に定量的な評価方法が推奨されており、その具体的な方法として抽出液を用いる4種類の試験法がAnnex A～Dに記載されています。

USPあるいはISO 10993-5のAnnex A～Dに記載された5種の試験法 [Elution法 (USP)、NRU法 (Annex A)、コロニー形成法 (Annex B)、MTT法 (Annex C) およびXTT法 (Annex D)]では、試験試料から得た抽出液を、細胞密度がサブコンフルエント状態の接着細胞に曝露します。

Elution法では、曝露後の細胞を位相差顕微鏡下で観察し、形態学的変化をグレード毎に点数化するため、通常、細胞毒性作用は半定量的に評価されます。

ただし、顕微鏡観察後の細胞を色素染色したのち吸光度測定を行い、色素量を数値化することにより、細胞毒性作用を定量的に評価することも可能です。

3種の試験法 (NRU法、MTT法およびXTT法) は、96ウェルマイクロプレートを用いて細胞を曝露したのち吸光度測定を行い、指標とする色素量を数値化することにより細胞毒性作用を定量的に評価する方法です。